智能水浴冷凝回流提取儀在飼料中維生素 A 檢測皂化前處理的應(yīng)用

維生素是動物所需的五大營養(yǎng)素之一，其中維生素A是視紫紅質(zhì)（感光色素）的重要組成部分，具有維持正常的視覺，促進生長發(fā)育，維持上皮結(jié)構(gòu)完整健全和增強動物免疫力等作用。為滿足動物生長需求，常在動物飼料中添加。

現(xiàn)行有效的飼料中維生素A測定的國家標準為GB/T 17817-2010 飼料中維生素 A 檢測皂化，其前處理方法包括皂化提取法和直接提取法。皂化提取法適用于配合飼料、濃縮飼料、復(fù)合預(yù)混合飼料和維生素預(yù)混合飼料中維生素A的測定。直接提取法僅適用于維生素A含量較高的維生素預(yù)混合飼料中維生素A的測定。目前皂化提取過程實驗室多自行搭建水浴回流裝置，操作繁瑣，占用人工。本試驗對自行搭建水浴回流裝置與一套集成加熱、磁力攪拌、自動升降、定時啟停、冷熱水雙浴的陣列水浴回流儀進行比較，試驗證明集成一體的陣列水浴回流儀有效優(yōu)化了皂化前處理過程,達到了簡化實驗過程，減少人工操作，提升實驗效率的目的。

1. 材料與方法

1.1 儀器

NAI-HL10S智能水浴冷凝回流提取儀

《中國藥典》浸出物的測定法中醇溶性熱浸法 脂肪與脂肪油測定法中藥浸提回流法

GB 5009.168-2016 食品安全國家標準 食品中淀粉總酸維生素A、D、E脂肪酸的測定

GB 31604.5-2016 食品安全國家標準 食品接觸材料及制品 樹脂中提取物的測定

GB/T 5009.127-2003 食品包裝用聚酯樹脂及其成型品中鍺的測定

GB/T 8021-2003 石油產(chǎn)品皂化值測定法

GB/T 17817-2010 飼料中維生素 A 檢測皂化

GB/T 10345-2022 白酒分析方法（總酯和酸酯總量的測定）

土壤分析技術(shù)規(guī)范 甲亞胺-H比色法 土壤中硼的測定（提硼回流裝置-石英冷凝回流提取儀）

1.2 標準品、試劑

維生素A乙酸酯標準品，含量≥99%。

無水，分析純，經(jīng)檢驗無過氧化物；無水乙醇，分析純；甲醇，色譜純；2,6二叔丁基對甲酚（BHT），分析純；無水*，分析純；氮氣（純度99.9%）；碘化鉀溶液100g/L；淀粉指示劑5g/L；硫代*溶液50g/L;氫氧化鉀溶液500g/L；L-抗壞血酸溶液5g/L；酚酞指示劑10g/L。

1.3 標準溶液配置

維生素A標準儲備液：稱取維生素A乙酸酯標準品34.3mg（精確至0.0001g）于皂化瓶中，按前處理方法進行皂化和提取，將提取液全部濃縮蒸發(fā)至干，用正己烷溶解殘渣置入100mL棕色容量瓶中并稀釋至刻度，混勻，4℃保存。

維生素A標準工作液：準確吸取1.00mL維生素A標準儲備液置于100mL棕色容量瓶中，用氮氣吹干，用甲醇稀釋至刻度，混勻。

1.4 前處理方法

稱取配合飼料10g于250mL圓底燒瓶中，加入50mL L-抗壞血酸溶液，使試樣分散、浸濕，加10mL氫氧化鉀溶液，混勻。置于沸水浴上回流30min，不時振蕩防止試樣粘附在瓶壁上，皂化結(jié)束，分別用5mL無水乙醇、5mL水自冷凝管頂端沖洗其內(nèi)部，取出燒瓶至冷水浴中冷卻至40℃。

定量轉(zhuǎn)移全部皂化液于盛有100mL無水的500mL分液漏斗中，用50mL水分3次沖洗圓底燒瓶并入分液漏斗，加蓋、放氣、隨后混合，激烈振蕩2min，靜置、分層。轉(zhuǎn)移水相于第二個分液漏斗中，分別用100mL、60mL重復(fù)提取兩次，棄去水相，合并三次相。用水每次100mL洗滌提取液至中性。提取液通過無水*脫水，轉(zhuǎn)移至250mL棕色容量瓶中，加100mg BHT使之溶解，用定容。

從提取液中分取適當體積旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用甲醇溶解后過0.45um膜過濾，進樣測試。

1.5 儀器條件

色譜柱：C18型柱；

流動相：甲醇+水（95:5）；

流速：1.0mL/min；

柱溫：室溫；

進樣量：20ul；

檢測波長：326nm。

2. 結(jié)果與討論

2.1 皂化前處理裝置對比

皂化前處理是維生素A測試關(guān)鍵前處理過程，傳統(tǒng)人工搭建水浴回流裝置，操作繁瑣，占用人工。皂化前處理過程中，需要不時振蕩以防止試樣粘附在瓶壁上，實驗人員需要多次拆卸圓底燒瓶，振蕩后再安裝進行水浴回流，需要實驗人員一直值守。陣列水浴回流儀可以同時處理6個樣品，通過搭載間歇磁力攪拌，免去了人工振蕩過程，加上定時啟停、自動升降功能，實現(xiàn)無需人員值守。實驗比較了傳統(tǒng)人工搭建水浴回流裝置和陣列水浴回流儀皂化前處理過程，證明陣列水浴回流儀能夠有效優(yōu)化簡化實驗過程、減少人工操作、提升皂化前處理效率。

表1 智能水浴冷凝回流提取儀參數(shù)設(shè)置

2.2 樣品加標回收實驗

稱取10g空白復(fù)合預(yù)混飼料樣品12份，添加10mg維生素A乙酸酯標準品，分別使用自行搭建水浴回流裝置和陣列水浴回流儀進行皂化前處理，經(jīng)提取、濃縮后上機測試，計算兩種裝置回收率。自行搭建水浴回流裝置回收率在94.1%~97.8%之間，陣列水浴回流儀回收率在97.3%~99.8%之間，陣列水浴回流儀回收率略優(yōu)于自行搭建水浴回流裝置，測試結(jié)果見表2。

表2 不同皂化裝置回收率

2.3 方法重復(fù)性

分別使用自行搭建水浴回流裝置和陣列水浴回流儀對同一飼料樣品進行前處理，兩種裝置分別進行6次平行測定。自行搭建水浴回流裝置6平行測試相對標準偏差為3.75%，陣列水浴回流儀為1.74%，使用陣列水浴回流儀進行皂化前處理重復(fù)性優(yōu)于自行搭建水浴回流裝置，結(jié)果見表3。

表3 不同皂化裝置重復(fù)性

3. 結(jié)論

試驗分別采用自行搭建水浴回流裝置和陣列水浴回流儀對飼料中維生素含量進行測定，從整個測定過程來看，陣列水浴回流儀通過集成皂化前處理操作，尤其是間歇攪拌功能、自動升降功能，大大簡化了實驗過程，減少了人工操作。同時，多樣品自動同時處理，在樣品的準確度和重復(fù)性上要優(yōu)于人工搭建水浴回流裝置，陣列水浴回流儀可以很好應(yīng)用于飼料中維生素A的測定。